Krebsmetastasen gehen von proliferativen zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus, die sich vom Primärtumor über Blut- und Lymphgefäße ausbreiten. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die CTC-Analyse aus Blutproben für diagnostische und prognostische Zwecke sowie zur Therapie-überwachung im Rahmen der Flüssigbiopsie etabliert. Die geringe Anzahl von CTCs im Vergleich zu Milliarden von Blutzellen in einer Patientenprobe erfordert jedoch sensible Methoden, um reproduzierbare Tumorzellgewinnungsraten zu erzielen.

Vor diesem Hintergrund hat das Fraunhofer-Institut für Mikrotechnik und Mikrosysteme den dringenden Bedarf an standardisierter CTC-Isolierung erkannt und automatisierte mikrofluidische Plattformen zur Anreicherung, Detektion und Isolierung einzelner Tumorzellen aus 7,5 mL Vollblut entwickelt. Ziel der hier vorgestellten Dissertation war die Realisierung einer Einzelzellisolierung durch eine automatisierte Anreicherung basierend auf immunmagnetischen Partikeln und eine antikörperbasierte Fluoreszenzdetektion in einem Chip-basierten mikrofluidischen System und eine darauffolgende molekularbiologische Charakterisierung dieser Zellen, um Tumormerkmale aus Flüssigbiopsien nachzuweisen.

Die Arbeit vergleicht daher die manuelle und die automatisierte immunomagnetische Anreicherung hinsichtlich der Zellausbeute in Abhängigkeit von Zelllinie und Inputzahl, Partikeleigenschaften, Biofunktionalisierungsprotokoll und Blutzellkontamination mit Fokus auf Kopf-Hals-Tumoren (HNSCC) und metastasiertem Brustkrebs. In einem Prototyp-Anreicherungsgerät (IsoMAG) wurde ein Isolierungsprotokoll mit effektiven EpCAM-funktionalisierten 1 µm Magnetpartikeln für die automatisier-te Anreicherung etabliert, das an verschiedenen epithelialen Krebszelllinien getestet wurde.

Die Kontamination mit weißen Blutkörperchen, die eine weitere Analyse der angereicherten Tumorzellen behindert, wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen und auf etwa 1200 Zellen aus 7,5 mL Blut minimiert. In der mikrofluidischen Benchtop-Plattform CTCelect wurde jeder Prozessschritt mit zwei verschiedenen Karzinomzelllinien (MCF-7, SCL-1) charakterisiert und dabei eine Anreicherung von bis zu 87 Prozent und eine optische Detektions- und Dispensiereffizienz von 73 Prozent nach-gewiesen. 40 bis 56,7 Prozent der Zellen wurden nach vollständiger Isolierung aus 7,5 mL unbehandeltem Vollblut zurückgewonnen.

Ferner wurden die Herausforderungen der mikrofluidischen Zellisolierung in Abhängigkeit von der Bindung der Magnetpartikel an die Zelloberfläche aufgezeigt und eine Gating-Funktion für die Zytometer-Untereinheit implementiert, um selektiv Zellen anstelle von autofluoreszierenden Objekten zu dispensieren. Auf diese Weise ermöglichte CTCelect die automatisierte Dispensierung einzelner zirkulierender Tumorzellen aus HNSCC-Patientenproben, die qPCR-basierte Bestätigung tumor-assoziierter Biomarker mit einem vereinfachten Ein-Schritt-Protokoll und die bildgebende Antikörperfärbung an einem Panel von Tumormarkern. Darüber hinaus wurde die Plattform mit kommerziellen CTC-Isolierungstechnologien verglichen, um die Vor- und Nachteile von CTCelect aufzuzeigen.

Zusammengefasst tragen die erzielten Ergebnisse wesentlich zur Etablierung der Plattformtechnologie in der angewandten Forschung im Bereich der Flüssigbiopsie bei.